Морфологические аспекты токсического и побочного действия эстразина

К основным гормональным средствам, используемым при лечении злокачественных образований животных и человека, относятся стероидные гормоны (андрогены, эстрогены, гестогены), их синтетические аналоги и антигормоны (антиэстрогены, антиандрогены, антипрогестины и препараты, сочетающие в себе действие двух антигормонов). В последнее время большое внимание уделяется созданию эффективных в противоопухолевом отношении гормональных препаратов из групп гормоноцитостатиков, гипоталамических гормонов и их аналогов (З.С. Смирнова 200); В.М. Ржезников и соавт., 1996).

Создание новых лекарственных средств для терапии рака остается актуальной проблемой, поскольку все существующие в настоящее время препараты характеризуются недостаточной активностью, низкой избирательностью специфического действия, высокой токсичностью.

При доклиническом изучении токсических и побочных эффектом (безвредности) новых противоопухолевых препаратов (далее — ПП) особое место занимают патоморфологические исследования — обязательные в доклиническом изучении безвредности каждого нового ПП, поскольку результаты функциональных токсикологических исследований не всегда дают возможность корректного прогноза интенсивности повреждений органов и тканей, и степени их обратимости.

Исследования патоморфологических изменении (далее — ПИ) позволяют выявить нежелательные повреждающие эффекты на нормальные органы и ткани животных; находить границы применения безопасных доз изучаемых препаратов, выявить их тропность к определенным тканям. Исследование последнего аспекта особенно важно при изучении новых гормональных препаратов и гормоноцитостатиков — препаратов с комбинированным биологическим действием (гормональным и цитостатическим). Морфологические исследования позволяют прогнозировать чувствительность опухолей конкретных локализаций к изучаемому препарату и/или спектр органов-мишеней его побочного действия.
Патоморфологическая и функциональная оценка действия препарата на органы и ткани животных — одно из ведущих звеньев в сложной программе доклинического изучения новых ПП. Она гарантирует безопасность клинического применения препарата, позволяет рациональнее строить его терапевтические режимы.

Цель исследования
Морфологическая оценка характера и особенностей токсического и побочного действия (безвредности) нового гормонального препарата эстразин.

Задачи исследования
1.    Исследование ПИ внутренних органов собак, изучение зависимости побочного и токсического действия эстразина от режима применения и величины дозы при ректальном введении: однократном (острая токсичность препарата) и многократном (курсовом)(хроническая токсичность).
2.    Исследование ПИ внутренних органов крыс при многократном (курсовом) внутрибрюшинном применении эстразина (хроническая токсичность).
Патоморфологическая оценка обратимости и скорости репаративных процессов в органах и тканях животного после применения эстразина.
4. Исследование местно-раздражаюшего действия (далее — МРД) эстразина при его ректальном применении у собак.

В работе изучено действие на нормальные внутренние органы животных (крыс и собак) эстразина — нового отечественного гормонального ПП.
Эстразин синтезирован путем прибавления к эстрону гидразоновой группы =NH-NH2. Предполагалось, что замещение карбонильной группы в молекуле стероида на гидразоновую должно пролонгировать гормональное действие соединения и его противоопухолевый эффект в связи со способностью простейших гидразонов стероидных кетонов подвергаться в организме окислению с образованием реакционноспособных диазостероидов, более прочно связывающихся с рецепторами соответствующих гормонов.

Эстразин представляет собой 3-оксиэстра-1,3,5-триен- 17-гидразон соединение. По структуре входящего гормона (эстрон) и модифицирующего фрагмента (гидразоновая группировка) препарат не имеет аналогов среди применяющихся для лечения рака предстательной железы эстрогенов: синэстрол, диэтилстиль-бэстрол, эстрадурин, этинилэстрадиол, фосфэстрол, хлортрианизен.

Лекарственная форма эстразина — свечи на водорастворимой полиэтиленоксидной основе для ректального введения, разработанные в Украинском НИИ фармакотерапии эндокринных заболеваний (бывший Харьковский НИИ Эндокринологии и химии гормонов).

Для исследования ПИ внутренних органов животных при применении эстразина использовано 14 собак — самцов породы английский бигль в возрасте 8-24 месяцев и массой 6-13 кг и 75 самцов крыс.

Опыты на собаках
Препарат вводился животным ректально в лекарственной форме, представляющей собой свечи, состоящие из 210 мг эстразина и 1290 мг полиэтиленоксида. В качестве контроля использованы собаки, получавшие per rectum свечи без эстразина (плацебо).

Препарат вводили однократно (опыты по острой токсичности) или многократно (опыты по хронической токсичности) (таблицы 1, 2).

Таблица 1. Схема эксперимента по изучению острой токсичности эстразина у собак

Примечание: однократное введение per rectum; лекарственная форма — свечи.

Таблица 2. Схема эксперимента по изучению хронической токсичности эстразина у собак

Примечание: 20-кратное введение per rectum; лекарственная форма — свечи.



Эутаназию собак тиопенталом натрия производили утром, натощак (внутривенное введение 100 мг/кт).

Для гистологического исследования были взяты: пищевод, желудок, 12-перстная, тощая, подвздошная, ободочная и прямая кишки, печень, почки, аорта, легкие, сердце, лимфатические узлы, селезенка, мочевой пузырь, надпочечники, семенники, гипофиз, поджелудочная, щитовидная и предстательная железы.
Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, Суданом 3.

Опыты на крысах
Крысам эстразин вводили внутрибрюшинно в дозах 100, 200, 500 мг/кг ежедневно на протяжении 20 дней. В качестве контроля использовали интактных крыс и крыс, получавших свечи без эстразина плацебо внутрибрюшинно в том же режиме. Для внутрибрюшинного введения свечей с эстразином и плацебо их измельчали и растворяли в дистиллированной воде, вводили по 6,3 мл (таблица 3).

Таблица 3. Схема эксперимента по изучению хронической токсичности эстразина у крыс

Примечание: 20-кратное введение внутрибрюшинно; лекарственная форма —раствор 6, J мл.



Эутаназию крыс диэтиловым эфиром (5 голов из каждой группы) проводили через 2, 30 и 120 суток после окончания курсовых введений.

Для гистологических исследований взяты: желудочно-кишечный тракт, сердце, легкие, печень, почки, селезенка, тимус, лимфатические узлы, щитовидная и поджелудочная железы, гипофиз, надпочечники, мочевой пузырь, семенники.

Результаты исследований ПИ внутренних органов собак
После однократного ректального применения свечей эстразина в дозах 140 и 280 мг/кг во внутренних органах собак на ранних сроках исследования обнаруживались признаки расширения и полнокровия. капилляров и венул органов, отек, ПИ были умеренными и наблюдались в тонком и толстом отделах кишечника, почках, печени, легких, предстательной и щитовидной железах, гипофизе. Глубина изменений зависела от дозы и времени после воздействия препарата.

Изменения в тонком кишечнике в ранние сроки после однократного применения носили характер альтеративного воспаления, приобретая в поздние сроки признаки хронического воспаления с четкими репаративными проявлениями.

Изменения в толстом кишечнике (ободочная и прямая кишка) отражали умеренное обратимое МРД эстразина.

В почках и печени дистрофические изменения паренхиматозных клеток в ранние сроки сопровождались нарушением сосудистой проницаемости эндотелия клубочков почек и синусоидов печени, по-видимому, способствуя более стойким изменениям в этих органах в поздние сроки (120 сутки).

Изменения в семенниках, предстательной и щитовидной железах в ранние сроки после применения эстразина носили выраженный деструктивный и атрофический характер.

Позднее (30-120 сутки) в этих органах преобладали признаки репаративной регенерации. Выраженные атрофические и деструктивные изменения сохранялись к 120 суткам лишь у собак, получавших эстразин в дозе 280 мг/кг.

В гипофизе собак отмечено увеличение числа эозинофильных клеток. В надпочечниках отмечена гиперплазия клубочкового и субклубочкового слоев. К 120 суткам эти изменения в гипофизе и надпочечниках собак практически исчезали.

Изменения в легких собак носили характер хронического воспаления с картиной обострения в ранние сроки и выраженной репаративной регенерацией в поздние сроки после применения эстразина.

ПИ внутренних органов собак при курсовом ректальном введении эстразина
После хронического применения эстразина у собак в суммарных дозах 700 и 1400 мг/кг в виде ректальных свечей четкие морфологические изменения обнаруживались в почках, печени, ЖКТ, легких, сердце, эндокринных и половых железах собак. Изменения сопровождались сосудистыми нарушениями в виде отека, полнокровия и расширения капилляров и венул, иногда геморрагии. Глубина морфологических изменений в органах зависела от дозы и сроков после прекращения воздействий. В большинстве органов эти изменения были обратимы и исчезали к 30 и 120 суткам.

В почках стойкие и сохранявшиеся в большей или в меньшей степени до 120 суток дистрофические и деструктивные изменения канальцевых и клубочковых структур выявлялись на фоне выраженного отека, застойных сосудистых проявлений.

В печени умеренные дистрофические изменения гепатопитов, расширение синусоидов, пространств Диссе, отмеченные в ранние сроки, практически исчезали к концу наблюдения (120 сутки).

В желудке, миокарде, мочевом пузыре очаговые дистрофические изменения клеток, сосудистые нарушения были полностью обратимы к 30 и 120 суткам.

В легких и тонком кишечнике в ранние сроки обнаруживались выраженные воспалительные изменения с признаками обострения хронических проявлений. В поздние сроки после окончания введений эстразина в этих органах преобладали репаративные изменения.

Изменения в прямой и ободочной кишках отражали умеренное обратимое МРД.

Изменения в половых и эндокринных органах, с одной стороны, отражали токсический эффект высоких доз эстразина, а с другой — действие его гормонального компонента. Так, в семенниках и простате отмечены очаговые деструктивные и атрофические изменения, сохранившиеся в большей или меньшей степени до 30 суток и практически исчезнувшие к 120 суткам.

В фолликулах щитовидных желез собак отмечено нарушение структуры и образование коллоида. Признаки частичной нормализации в фолликулах наблюдались на 30 сутки на фоне очаговых атрофических изменений. Полное восстановление структур железы наблюдалось на 120 сутки.

В гипофизе — четкое увеличение числа эозинофильных клеток, преобладание которых сохранялось и до 120 суток.

В надпочечниках собак в ранние сроки после применения обеих доз эстразина отмечена умеренная (обратимая к 30 или 120 суткам) гипоплазия пучкового слоя.
Исследование МРД препарата проведено на 14 собаках в опытах по изучению острой и хронической токсичности препарата.

Эстразин в виде свечей вводили per rectum однократно в дозах 140 и 280 мг/кг или многократно в дозах 35 и 70 мг/кг (20 дней). В качестве контроля использовались собаки, получавшие ректально свечи без эстразина.

Эутаназию собак тиопенталом натрия проводили через 7, 30 и 120 суток после многократных введений эстразина.

Изучение ПИ прямой и ободочной кишок собак после однократного ректального введения свечей с эстразином.
Макроскопически в слизистых оболочках прямой и дистального отдела ободочной кишок через 7 суток после введения свечей с эстразином в дозах 140 и 280 мг/кг отмечена умеренная, неравномерная гиперемия, отек. Через 30 и 120 суток изменений не обнаружено. При гистологическом исследовании прямой кишки через 7 суток после введения отмечены признаки отека, участки очаговой и тотальной десквамации эпителия крипт, расширение лимфатических и кровеносных сосудов. воспалительная инфильтрация. В ободочной кишке — отек, очаговые деструктивные изменения эпителия крипт, отсутствие слизеобразования. Деструктивные, воспалительные и атрофические изменения при дозе 280 мг/кг выражены сильнее в обоих отделах толстой кишки. Через 30 суток после однократного введения свечей с эстразином в дозах 140 и 280 мг/кг в слизистой отмечены признаки выраженной регенерации эпителия, рубцовые изменения на месте эрозий, восстановление слизеобразования. Сохранялись участки атрофии апикальных участков крипт.
Через 120 суток в прямой и ободочной кишках отмечено полное восстановление.

Изучение ПИ прямой и ободочной кишки собак после курсового введения свечей с эстразином.
Макроскопически изменения слизистых оболочек прямой и дистального отдела ободочной кишки через 1 сутки после курса ректального введения свечей с эстразином и плацебо были сходными и выражались в умеренной гиперемии. На 30 и 120 сутки изменений не обнаруживалось.

При морфологическом изучении этих слизистых у собак, получавших свечи без эстразина, отмечен небольшой отек, встречались участки десквамации поверхностного эпителия крипт, умеренная воспалительная инфильтрация, полнокровие и расширение капилляров и венул. У собак, получавших свечи с эстразином (35 и 70 мг/кг, суммарно 700 и 1400 мг/кг), в слизистых наблюдали подобные морфологические изменения, обнаруживались мелкие участки кровоизлияний.

Через 30 суток после окончания введений собакам свечей с эстразином (35 мг/кг, всего 700 мт/кг) отмечали выраженную регенерацию эпителия, сохранялись отдельные инфильтраты. После окончания введения собакам свечей с эстразином в дозе 70 мг/кг (всего 1400 мг/кг) в слизистых оболочках прямой и ободочной кишок сохранялись участки, лишенные поверхностного эпигелия.

К 120 суткам в слизистых всех собак отмечены выраженные репаративные изменения эпителия крипт и рубцовые изменения в строме крипт.

Исследование показало, что лекарственная форма эстразина в виде ректальных свечей вызывает умеренное обратимое МРД в слизистой прямой и ободочной кишок собак как при однократном, так и при многократном применении.

Морфологические проявления МРД эстразина более выражены при однократном применении и зависят от дозы препарата. Многократное применение свечей с эстразином и без него вызывает сходное МРД в прямой и ободочной кишке собак.

На основании полученных данных можно заключить, что лекарственная форма эстразина (ректальные свечи) может быть рекомендована для клинического применения.

ПИ внутренних органов крыс при курсовом внутриорюшинном применении эстразина
После курсового внутрибрюшинного введения эстразина в суммарных дозах 2000, 4000, 10000 мг/кг (разовые дозы — 100, 200, 500 мг/кг соответственно) морфологические изменения обнаруживались в печени, почках, семенниках, а также в лимфоузлах, тимусе, надпочечниках, щитовидной железе и гипофизе. Глубина морфологических изменений зависела от дозы и сроков после окончания его воздействий.

Изменения в печени, миокарде в ранние сроки после применения эстразина в суммарной дозе 2000 мг/кг были незначительными (очаги вакуолизированных клеток). С увеличением дозы очаги дистрофии становились более распространенными и увеличивались в размерах. Эти изменения были преходящими и исчезали к 30 суткам. При дозах 2000 и 4000 мг/кг в печени крыс на 120 сутки, наряду с участками вакуольной дистрофии по периферии долек, наблюдали предопухолевые изменения, локализующиеся центролобулярно, у одной крысы (2000 мг/кг) обнаружена гепатома (аденома).

В печени одной павшей крысы после применения эстразина в дозе 10000 мг/кг наблюдали участки некрозов.

В почках крыс изменения носили стойкий деструктивно-дистрофический характер. Они проявлялись на фоне выраженного интерстициального отека.

После применения эстразина в высокой токсичной дозе (суммарно 10000 мг/кг) характер изменений в почках в поздние сроки наблюдения соответствовал нефрозу.

В семенниках крыс в ранние сроки после применения эстразина в дозах 2000 и 4000 мг/кг отмечены очаговые дегенеративные и атрофические изменения сперматогенного эпителия, становившиеся более выраженными (вплоть до полной атрофии сперматогоний) при увеличении дозы до 10000 мг/кг. Характер восстановления в семенниках зависел от дозы эстразина. К концу наблюдения полного восстановления в семенниках не наблюдалось.

В лимфоузлах и тимусе крыс в ранние сроки после курсового воздействия отмечали очаговые деструктивные и атрофические изменения, глубина которых зависела от величины дозы препарата. Выраженные репаративные изменения в этих органах обнаруживались к 30 суткам, у единичных крыс очаговые атрофические изменения лимфоидной ткани сохранялись позднее.

В надпочечниках крыс наблюдалось преходящее увеличение коркового слоя, наиболее выраженное после применения эстразина в суммарных дозах 4000 и 10000 мг/кг.
В щитовидных железах отмечено обратимое увеличение содержания коллоида в фолликулах при всех использованных дозах эстразина. Увеличение числа крупных фолликулов с сопутствующим снижением количества интрафолликулярной ткани отмечено после применения эстразина в дозе 10000 мг/кг.

В гипофизе крыс после введения эстразина в дозе 2000 мг/кт выраженных изменений не обнаружено. Позднее были обнаружены участки гиперплазии. После доз 4000 и 10000 мг/кг отмечено снижение числа эозинофильных клеток в ранние сроки, сменявшееся их очаговой компенсаторной гиперплазией на 120 сутки.

В легких и тонком кишечнике морфологических особенностей, по сравнению с контрольными животными, не выявлено.

В остальных изученных органах (пищевод, желудок, толстый кишечник, аорта, мочевой пузырь, селезенка, поджелудочная железа) изменений не обнаружено, или они были незначительными и преходящими.

Выводы
1.    По степени выраженности морфологических изменений внутренних органов лабораторных животных новый ПП эстразин может быть отнесен к категории низкотоксичных.
2.    При однократном и курсовом применении эстразина у собак и крыс морфологические изменения обнаружены в почках, печени, эндокринных, половых железах, сердце, легких, кишечнике и лимфопролиферативных органах.
3.    Глубина и характер повреждений зависят от вида животных, дозы эстразина, способов его введения и сроков наблюдения.
Органами, наиболее чувствительными к токсическому действию эстразина, у собак являются почки, печень, у крыс — почки, печень и семенники.
5.    У собак морфологические изменения в органах и тканях сопровождаются более четкими, чем у крыс, сосудистыми нарушениями (отек, полнокровие и расширение капилляров и венул).
6.    Морфологические изменения, обусловленные токсическим действием эстразина, в большинстве органов обратимы и исчезают практически полностью к 30-120 суткам после применения препарата. Исключение составляют почки и печень, морфологические изменения в которых у отдельных животных сохраняются позже 120 суток.
7.    Лекарственная форма препарата эстразин — ректальные свечи — вызывает умеренное обратимое МРД как при однократном (в большей мере), так и при многократном применении, и может быть рекомендована для практического применения.