FIP. Современные подходы к диагностике инфекционного перитонита кошек

Инфекционный перитонит кошек (ИПК, Feline infectious peritonitis, FIP) ― тяжелое заболевание животных семейства кошачьих, приводящее к летальному исходу. Возбудитель ИПК входит в состав группы таксономически близких коронавирусов, включающую вирус энтерита кошек (ЭК), трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) и коронавирус собак (CCV). Имеются данные, что вирус ИПК образуется в результате мутации авирулентного кишечного вируса ЭК. При этом вирус приобретает вирулентность, способность поражать моноциты и макрофаги и вызывать тяжелый перитонит. Сложность серологической диагностики ИПК связана с высоким антигенным сходством коронавирусов, в частности вирусов ЭК и ИПК и, соответственно, практически идентичным спектром генерируемых антител. Цель работы заключалась в определении диагностической ценности детекции антикоронавирусных антител методами иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинга.

Объектом исследования являлись сыворотки крови от здоровых кошек, от подозрительных по заболеванию и клинически больных животных. Сыворотки получали из ветеринарных клиник, а также частных питомников и приютов. Диагноз подтверждали клиническими или патолого-анатомическими исследованиями.

В первую очередь была сконструирована тест-система для определения антител к коронавирусу в формате непрямого ИФА. В качестве антигенов использовали очищенные в градиенте плотности сахарозы вирусы ИПК и ТГС. Показана 100% корреляция иммунохимической специфичности антител сероположительных сывороток кошек к вирусам ИПК и ТГС. В связи с этим, далее в качестве антигена использовали вирус ТГС, культивирование которого хорошо отлажено в нашей лаборатории. Опосредованную сорбцию вирусных антигенов на планшет осуществляли с помощью специфических моноклональных антител к вирусу ТГС. После инкубации с исследуемыми сыворотками, вирус-специфические сывороточные антитела детектировали с помощью специально полученных поликлональных антител к IgG кошки, конъюгированных с пероксидазой хрена.

На первом этапе исследования проводили скрининговое исследование сывороток крови в одном разведении (1/200) для выявления животных с антителами к коронавирусу с помощью разработанного иммуноферментного метода. Затем отобранные положительные сыворотки титровали с разведениями от 1/200 до 1/25600.

При исследовании в таком алгоритме (первичный скрининг с последующим титрованием) 131 сыворотки кошек индивидуального содержания (пациенты ветеринарных клиник) выявлены следующие закономерности (Таблица 1).


Таблица 1
Результаты определения титров антител к коронавирусу в сыворотках крови кошек


У здоровых животных титр антител в ИФА не превышал значения 1:400 (46% животных). Часть животных (23%) без клинических признаков заболевания имела титр антител от 1:800 до 1:1600, что может свидетельствовать об инфицированности как вирусом ИПК, так и вирусом ЭК. Высокие ( ≥ 1:3200) титры антител к коронавирусу, определяемые методом ИФА, выявлены только у животных с клиническими признаками ИПК (29% животных). Следует отметить, что у 2% животных, уровни определяемых в ИФА антител были достаточно низкими (≤ 1:400), однако наблюдалась проявление клинической картины ИПК. Такой эффект может быть связан с наличием в организме большого количества вируса, который блокирует антитела и препятствует связыванию антител с вирусным антигеном, сорбированным на планшете.

Нами были также исследованы 120 животных из приюта и 22 – из питомника. Характерно, что у 52% животных методом ИФА выявлен довольно высокий уровень антител к коронавирусу (1/800 – 1/1600). Хотя клинических признаков заболевания ни у одного животного не было, формально все они находятся в «группе риска».

Т.е., при скученном содержании животных, по-видимому, имеет место латентное вирусоносительство из-за которого общий уровень антител выше, чем у животных при индивидуальном содержании.

Из полученных данных следует, что более важным прогностическим и диагностическим показателем является не сам факт наличия антител к коронавирусу, а их высокие титры с тенденцией быстрого увеличения, что прямо коррелирует с тяжестью клинического проявления болезни.

Мы исследовали также возможность использования метода иммуноблоттинга в качестве подтверждающего метода для диагностики ИПК. Показано, что в сыворотках крови с низким титром вирус-специфических антител (≤ 1:400) в ИФА, методом иммуноблоттинга выявлялся только один белок N вируса ТГС, однако по мере повышения титров антикоронавирусных антител увеличивался и спектр детектируемых вирусных антигенов.

Сыворотки крови с высокими титрами антител (≥ 1:3200) детектировали все основные структурные белки коронавирусов (N, S, M) (Рис.1).


Рис. 1. Иммуноблоттинг для выявления антител к коронавирусу.
А – окраска суммарных белков в геле Кумасси G-250: 1 – маркеры молекулярной массы 200, 150, 120, 100, 85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 кД, 2 – вирус ТГС, стрелками отмечено положение основных белков вируса ТГС;
Б – обработка вирусных антигенов после электропереноса на ПВДФ мембрану сыворотками крови кошек: 3 – сыворотка крови клинически здоровой кошки, 4…13 – сыворотки крови, положительные в ИФА, титр 1:200 (4, 5), титр 1:400 (6, 7), титр 1:800 (8), титр 1:1600 (9), титр 1:3200 (10, 11), титр 1:6400 (12, 13).



Таким образом, при сопоставлении результатов иммуноблоттинга и ИФА с анамнезом и патоморфологической картиной можно заключить, что изменение специфичности сыворотки крови по отношению к основным структурным белкам коронавируса имеет важное значение при постановке диагноза ИПК. Так, при выявлении антител к высокомолекулярным белкам (М.м. > 85 кД) коронавируса и прежде всего к S- белку в сыворотке крови кошек, диагноз на ИПК можно считать подтвержденным. Детекция одного N-белка (М.м. 45 кД) коронавируса в иммуноблоттинге не позволяет поставить диагноз на ИПК и его можно считать отрицательным.

Однако наличие антител к N-белку совместно с антителами к другим низкомолекулярным белкам (М.м. < 45 кД) может свидетельствовать о возможном инфицировании животного и в этом случае, как и в случае ИФА, анализ следует повторить через 1-2 недели.
Показано также, что у животных с высокими титрами антител (≥ 1:3200), достоверно повышен уровень суммарного белка в крови и снижено соотношение альбумин/глобулин (Рис.2). Изменения уровней билирубина и альбумина не выявлено.


Рис.2. Изменение уровня общего белка в крови (А) и соотношения альбумин/глобулин (Б) у кошек с различными титрами антител к коронавирусу

Заключение. Разработанная иммуноферментная тест-система для определения антител к коронавирусу методом непрямого ИФА может быть использована в практической ветеринарии для диагностики ИПК. Диагностическое значение иммуноферментного метода определения антикоронавирусных антител было определено при исследовании сывороток крови кошек с подозрением на ИПК и животных с подтвержденным диагнозом ИПК. Для правильной интерпретации результатов ИФА обязательно определение титров антикоронавирусных антител. Высокие титры антител считаются типичными для генерализованной инфекции и в сочетании с клиническими симптомами ИПК могут быть важным прогностическим показателем. Титр антител в ИФА выше, чем 1/3200 является диагностическим титром.

Предложенный метод иммуноблоттинга может быть эффективно использован в качестве подтверждающего теста для диагностики ИПК. При наличии в сыворотке антител к S – белку коронавируса диагноз на ИПК можно считать подтвержденным.

Показана также корреляция между уровнем антикоронавирусных антител, уровнем общего белка в и соотношения альбумин/глобулин.

Терехова Ю.О.
Научный сотрудник лаборатории диагностики, терапии и профилактики вирусных болезней АНО «НИИ ДПБ», г. Москва.

Просмотров: 5696

стерилизация кошки стационар