Вирусный ринотрахеит: герпесвирусная инфекция кошек

Вирусный ринотрахеит кошек во всем мире признан причиной большинства заболеваний верхних дыхательных путей у домашних кошек. От 50 до 70% взрослых кошек (R.A. Crandell, 1973), а по результатам недавних исследований и до 97% (D.A. Dawson, J. Carman et al., 1998) имеют антитела к этому вирусу. Установлено, что инфекция может вызывать заболевание до 100% невакцинированных кошек. Синдром поражения верхних дыхательных путей был впервые выделен как самостоятельное заболевание у группы котят в возрасте 5-10 недель в 1957 году (Crandel, Maurer, 1958), а в 1959 году Комитет по Номенклатуре Вирусных Заболеваний Кошек, утвердил предложенное Crandell и Despeaux название нового инфекционного заболевания кошек: «Feline Viral Rhinotraheitis (FVR)».

Возбудитель инфекционного ринотрахеита кошек - герпесвирус кошек тип 1 (Feline Herpes Virus type -1, FHV-1) - ДНК содержащий вирус подсемейства герпесвирусы.
Общей характеристикой для данного семейства является быстрое размножение вируса в клеточных культурах с разрушением клеток, тенденция к установлению латентной инфекции в чувствительных нервных ганглиях после первоначальной инфекции. Другие вирусы животных, относящиеся к данному подсемейству, включают: герпесвирус лошадей тип 1, герпесвирус свиней тип 1 и герпесвирус КРС тип 1 и 2, герпесвирус собак тип 1 и др. Типичный герпесвирусный вирион состоит из сердцевины – двойной цепочки ДНК, находящейся внутри икосаэдрического капсида. Примыкающий к капсиду электоронноплотный материал называют интегументом. Конечная структура, окружающая вирион - вирусная оболочка, образуется из ядерной мембраны клетки-хозяина (рис. 1).



Рис. 1. Герпесвирус кошек.

Известное на сегодняшний день распространение вируса ограничивается странами, находящимися в северных и южных температурных зонах. Болезнь широко распространена в России, США, Канаде, Великобритании, Южной Африке, Австралии, Германии, Швеции, Австрии, Чехословакии, Венгрии, Индии, Италии, Франции, Шотландии, Румынии и др. Информация о сезонных вспышках FHV-1 инфекции отсутствует, хотя известно, что в кошачьих популяциях заболевание проявляется в виде энзоотических вспышек.
Вирус герпеса кошек - FHV-1 вызывает заболевание не только у домашних кошек (Felis catus). Первое сообщение о выделении FHV-1 от экзотических кошек было получено в 1977 году из зоопарка Святой Луизы, где FHV-1 послужил причиной смерти трех обычных и пяти пятнистых леопардов (Neofelis nebulosa) в единственной вспышке. В настоящее время опубликовано значительное количество работ о важной роли вируса герпеса кошек в возникновении заболеваний у диких кошек: дикой африканской (Felis silvestris) и песчаной (Felis margarita) кошек на Ближнем Востоке и в Южной Африке (S. Ostrowski, Van Vuuren M, M. Daniel, D.M. Lenain et al., 2003) и дикой европейской кошки (Felis silvestris silvestris) в Западной и Восточной Европе (M.J. Daniels, M.C. Golder, O. Jarrett et al., 1999).
 
Клинические формы и патогенез.
Несмотря на то, что смертность при FVR кошек достаточно низкая (за исключением котят, у которых она может достигать 30%), заболевание представляет чрезвычайно серьезную проблему, обусловленную вызываемыми FHV-1-поражениями.
Наиболее часто встречают респираторную форму инфекции в сочетании с окулярными поражениями. Наблюдаемый инкубационный период может составлять от 2-3 до 10 дней. Ранние признаки болезни характеризуются наличием серозных носовых и окулярных выделений, повышением температуры тела и кашлем. Скученное содержание заболевших животных может вызывать пароксизмальный кашель и чихание. По мере прогрессирования заболевания носовые выделения становятся слизистыми или слизисто-гнойными, температура тела повышается до 40-40,5оС. У животных можно наблюдать интенсивную саливацию, в некоторых случаях подчелюстные лимфоузлы могут значительно отекать. Больные животные обычно сохраняют способность самостоятельно принимать пищу и воду, если не возникает осложнений.
Описаны различные формы осложнений, как респираторных, так и нереспираторных; при более тяжелом респираторном синдроме, часто сопровождающемся вторичной бактериальной инфекцией, дыхание становится затрудненным из-за обструкции носовых путей. У пораженных животных наблюдают вялость, анорексию и дегидратацию. В случае развития интерстициальной пневмонии возникает одышка с характерными респираторными звуками (Love, 1971), в этом случае прогноз неблагоприятный.
Язвенный глоссит может сопровождать респираторную форму инфекции (Johnson, Thomas, 1966; Karpas, Routledge, 1968). Язвы ротовой полости и кожные язвы в области груди, боков, живота, конечностей и спины могут встречаться у кошек без каких-либо признаков респираторной инфекции (Johnson, Sabine, 1971) (A. Suchy, B. Bauder, W. Gelbmann et al., 2000). Однако, случаев возвратного рецидивирующего глоссита или стоматита, связанного с латентной инфекцией, такой как herpes simplex у человека, у кошек не описаны.

Отсутствие возвратных повреждений позволяет утверждать, что оральные повреждения являются результатом диссеминации вируса или просто инвазии вирусом поврежденных тканей. Случаи язвенных поражений ротовой полости или кожи у животных без признаков респираторного заболевания могут означать контактную инфекцию, передаваемую механически (R.A. Crandell, 1973).
Респираторный синдром при данном заболевании может сопровождаться генерализованной инфекцией (Karpas, Routledge, 1968; Spradbrow et al., 1971, Bistner et al., 1971). Аборты (Johnson, Thomas, 1966; Spradbrow et al., 1971) и поражения ЦНС, включая эпилептические припадки, могут сопровождать респираторную форму заболевания. Явления катарального энтерита с геморрагическим илеитом, метрита и вагинита связывают с возникновением аборта. Но поскольку вирус в этих случаях из плацент или плодов не выделяли, и не было обнаружено фетальных или плацентарных изменений, которые могли быть связаны с прямым действием вируса, авторы считают, что аборты могли быть связаны с некоторым неспецифическим механизмом, связанным с тяжелым истощающим респираторным заболеванием у беременной самки.
Отмечена тропность вируса к местам роста костей скелета, включая носовые раковины, что подтверждено в результате проведенных экспериментов после внутривенной инокуляции молодым котятам. Даже при естественной инфекции отмечали случаи остеолитического поражения носовых раковин с некрозом и резорбцией лежащей ниже кости. Таким образом, последствием переболевания FHV-1 инфекцией могут стать хронические риниты и синуситы.
Глазные проявления острой формы FHV-1 инфекции почти всегда билатеральны, и, в общем, ограничиваются поражениями конъюнктивы. Блефароспазм - первоначальный клинический признак, начинающий проявляться через несколько дней после заражения. Достигая пика к пятому дню, он начинает сопровождаться серозными выделениями. Последние сменяются слизистыми и слизисто-гнойными к 7 дню, начиная ослабевать к 10 дню. Внешний вид конъюнктивы при острой инфекции характеризуется сильнейшей гиперемией, конъюнктива набухает (отек средней силы), но хемоз конъюнктивы не характерен для FHV-1-инфекции. Повреждения конъюнктивы возникают вследствие прямого цитолитического действия герпесвируса. Отмечают значительный тропизм вируса именно к конъюнктивальному эпителию, корнеальные повреждения значительно менее заметны. Корнеальные дендритные (древо-, ветвевидные) фигуры видны как двусторонние узоры. Множество микродендритных фигур видны на роговице между третьим и шестым днями инфекции, возникая из-за размножения попадающего на роговицу вируса. Дендритные поражения исчезают к 6 дню и вновь появляются на 11 день, когда вследствие некроза конъюнктивы высвобождается новая волна вирусных частиц. Вторичные дендритные поражения значительно больше, иногда, срастаясь, они формируют амебовидные узоры, но их количество значительно меньше первоначальных.
Гистологические исследования демонстрируют, что корнеальная инфекция, в отличие от конъюнктивальной, характеризуется размножением вируса с меньшим цитопатическим эффектом и без воспалительной клеточной реакции. Корнеальная инфекция сопровождается слабой и временной поверхностной васкуляризацией, и ее исчезновение признаков совпадает с исчезновением признаков поражения респираторного тракта.
Значительно более серьезные глазные патологии встречаются у тех кошек, которые ранее переболели герпесвирусной инфекцией. Хотя возможна и реинфекция, вызванная другим штаммом FHV-1, более вероятно, что глазная инфекция у взрослых кошек возникает в результате реактивации латентного вируса. В отличие от классического течения признаки поражения верхних дыхательных путей отсутствуют, а глазные поражения часто унилатеральны. Признаки возвратной инфекции могут ограничиваться конъюнктивальными поражениями или вызывать кератиты различной тяжести. Во многих случаях, небольшая гиперемия конъюнктивы и периодические глазные выделения – единственные клинические признаки. Сильный отек конъюнктивы не характерен. У многих кошек можно наблюдать сухие коричневатые выделения, скапливающиеся в медиальном углу глаза, хотя неизвестно, является ли данный признак специфичным для герпесвирусной инфекции. Инфекция может длиться недели, месяцы, рецидивы часты.
Корнеальные поражения, связанные с возвратной FHV-1 инфекцией проявляются несколькими различными синдромами.

Простейшая форма.
Древовидные (дендритные) эпителиальные изъязвления в сочетании с конъюнктивитом. Дендриты могут персистировать длительный период времени и могут сопровождаться изменениями в подлежащей строме (отеком и поверхностной васкуляризацией роговицы). Дендритные повреждения, которые, увеличиваясь, становятся похожими на географическую карту, именуются «географическими». Очень часто, однако, FHV-1-корнеальная инфекция не проявляется характерными клиническими проявлениями, позволяющими отличить ее от других причин язвенного процесса в роговице. Дендритный кератит в случае вторичной (возвратной) FHV-1-инфекции возникает так же, как и при первичном заражении – за счет размножения вируса и разрушения эпителиальных клеток.

Стромальный кератит (СК).
Как проявление корнеальной FHV-1-инфекции встречается реже. Из-за своей потенциальной способности вызывать нарушающее зрение корнеальное рубцевание, СК считают наиболее тяжелым проявлением корнеальной герпесвирусной инфекции.
FHV-1-СК обычно сопровождается хроническими эпителиальными изъязвлениями и легко распознается по наличию стромального отека и глубокой васкуляризации; микроскопически обнаруживают воспалительно-клеточный инфильтрат. Механизм, обуславливающий возникновение СК, неизвестен. Поскольку FHV-1 в норме не размножается в кератоцитах, маловероятно, что стромальные повреждения связаны с прямым действием вируса. Установлено, что СК не развивается даже после экспериментального заражения кошек, сопровождающегося механической скарификацией корнеального эпителия и стромы. Несмотря на диффузный некроз инфицированных конъюнктивальных тканей, корнеальный эпителий остается интактным и скарифицированная строма быстро заживает. Однако если кошки одновременно получают кортикостероиды, развивается СК, в конечном счете, приводящий к фиброзу пораженных тканей. В этом случае развитию кератита у кошек предшествует хронический эпителиальный язвенный процесс и замедленное заживление дефектов стромы. Оба явления предположительно связаны с действием кортикостероидов, замедляющих эпителизацию и угнетающих синтез коллагена. В сочетании с продолжительным выделением вируса под влиянием этих же обстоятельств корнеальные стромальные ткани, таким образом, должны подвергаться максимальному воздействию вируса. Множество экспериментальных исследований показало, что СК, вызванный herpes simplex virus, есть иммунопатологический процесс, инициированный вирусным антигеном, что обеспечивает возможность воздействия на корнеальную строму. Предполагают, что роль медиаторов в данном процессе может играть цитотоксическое действие Т-лимфоцитов. Каким бы ни был механизм, хронические или возвратные эпизоды СК ведут к прогрессирующему повреждению коллагена, нарушению фибриллярной структуры и, в конечном счете – стромальному помутнению.
При глубоких стромальных язвах и десцеметоцеле в некоторых случаях можно выделить FHV-1 из слезной жидкости. Неизвестно, является ли вирус основным инструментом воздействия на роговицу в таких случаях. Кажется маловероятным, что вирус способен индуцировать расплавление стромы. Скорее всего, расплавление стромы медиируется вторичной бактериальной инфекцией или первичный бактериальный язвенный процесс просто вызывает реактивацию и выделение латентного вируса.
Некоторые серьезные глазные патологии у кошек (необязательно специфичные) можно наблюдать вместе с инфекционным ринотрахеитом, например, корнеальная секвестрация – синдром, при котором дегенерирует коллаген корнеальной стромы и накапливается темно-коричневый или черный пигмент, источником которого предположительно является слезная пленка. Хотя заболевают любые породы кошек, наиболее к ним предрасположены персидские и гималайские кошки. Гистологически секвестр состоит из лишенных кератоцитов изъязвленных стромальных тканей, окруженных различным числом лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов и, в меньшей степени, нейтрофилов. Характер воспалительного процесса рассматривают как неспецифическую иммунную реакцию, вызывающую дегенерацию коллагена. Гистологические характеристики корнеальных секвестров несовместимы с иммунным механизмом, предположительно ответственным за повреждения коллагена, видимые при СК. Возможно, что секвестральные повреждения возникают как результат инфекции кератоцитов или сверхвыработки провоспалительных цитокинов.
В 1998 году группой исследователей M.P. Nasisse, T.L. Glover, P. Cecil, et al. проверено 156 образцов роговицы кошек с корнеальным секвестром на предмет выявления ДНК FHV-1 - 55,1% (86/156 образцов) дали положительный результат. Количество выявленных ДНК FHV-1 у кошек с корнеальными секвестрами персидской и гималайской пород различалось незначительно, 42,7 и 58,3% соответственно. Однако, суммарный процент положительных результатов у этих двух пород (46,5%), был значительно ниже, чем у остальных длинношерстных и короткошерстных пород с корнеальными секвестрами (80%).
По мнению исследователей FHV-1 является только одной из многих потенциальных угроз для роговицы, которые могут ускорять и провоцировать формирование секвестра. То, что FHV-1 обнаруживают в секвестрах домашних кошек чаще, чем у персидских и гималайских, только подтверждает данную теорию. Можно предполагать, что разница в преобладании ДНК FHV-1 в секвестрах домашних кошек по сравнению с персидскими кошками (43%), связана исключительно с невирусными факторами, например с более частым повреждением роговицы вследствие присущего данной породе экзофтальма и лагофтальма. Это предположение согласуется и с результатами наших собственных наблюдений, которые показывают, что наиболее часто у персидских кошек секвестр возникает именно при повреждении центральной части роговицы, которая из-за лагофтальма и экзофтальма недостаточно защищается веками, подвергаясь, таким образом, максимальному повреждающему действию агрессивных факторов внешней среды, наиболее скудно омывается слезой, что, безусловно, замедляет регенерацию тканей и создает максимально благоприятные условия для отложения пигмента и формирования секвестра. При повреждениях периферических участков роговицы, хорошо омывающихся слезой и защищаемых веками, происходит нормальная регенерация эпителия роговицы, что в сочетании с интенсивной миграцией сосудов из области лимба создает условия для быстрого заживления дефекта. Именно созданием благоприятных факторов для регенерации роговицы, на наш взгляд, объясняется практически 100% успех послойной кератэктомии в сочетании с тарзоррафией. Хотя при данной методике часто удаляются участки роговицы до ? глубины и до 70% по площади, наблюдается быстрая регенерация тканей в течение двух-трех недель. Безусловно, значительная разница в числе положительных результатов у здоровых кошек (из 17 клинически здоровых кошек только одна (5,9%) была положительна на ДНК FHV-1) по сравнению с больными (55,1%), показывает, что существует определенная связь между вирусом FHV-1 и корнеальным секвестром (M.P. Nasisse, T.L. Glover, P. Cecil, et al., 1998). Однако эти данные не во всех случаях доказывают причинную роль именно FHV-1. У значительной части кошек, являющихся носителями FHV-1, вирус в латентном состоянии находится в тройничном ганглии и возможно в других тканях, таких как роговица, обонятельные луковицы и носовые раковины. Современные исследования (W.M. Townsend, J. Stiles and S.G. Krohne, 2001) показали, что при исследовании образцов роговицы и тройничных ганглиев от 46 кошек, не имевших в анамнезе респираторных или глазных заболеваний, ДНК герпесвируса кошек была выделена из 48,9% (45/92) препаратов роговиц и 41,3% (38/92) - тройничных ганглиев. Поскольку стимуляция чувствительных нервных окончаний способна реактивировать латентную инфекцию, возможно, что часть ДНК, определявшаяся в образцах с корнеальным секвестром, относится к латентному вирусу, который был реактивирован корнеальным воспалением и центробежно распространился в пораженных тканях.

Симблефарон.
Это прирастание участка конъюнктивы к самой конъюнктиве или роговице. Теоретически любое заболевание, значительно повреждающее конъюнктиву, может предрасполагать к формированию симблефарона. Но, принимая во внимание быстрый и обширный некроз конъюнктивального эпителия, который можно наблюдать при FHV-1 инфекции, вирус можно рассматривать как идеальный фактор, инициирующий формирование симблефарона. По наблюдениям M.P. Nasisse подавляющее большинство случаев симблефарона у кошек ассоциировалось с переболеванием в прошлом инфекцией конъюнктивы и верхних дыхательных путей (возможно FHV-1).

Энтропион.
Относительно редкая патология у кошек. Может быть самостоятельной проблемой, связанной с породной предрасположенностью, но во многих случаях проявляется вторично из-за хронического болевого раздражения, вследствие вирусного кератита. Трудно установить, что является его причиной, а что лишь следствием, но так называемый «спастический энтропион» у кошек является потенциальным осложнением блефароспазма, связанного с хронической FHV-1-инфекцией.
Есть подозрение, что FHV-1 может являться причиной сухого кератоконъюнктивита у кошек. Данная гипотеза построена на результатах недавнего экспериментального изучения, в котором уменьшение слезопродукции наблюдалось у 5 из 10 кошек с хронической FHV-1-инфекцией. Хотя механизм развития рассматривают лишь теоретически, тем не менее возможно развитие денита слезной железы или заращения выводных протоков. В других случаях, уменьшение слезопродукции при FHV-1 инфекции носит лишь временный характер (M.P. Nasisse, 1990).
Заболевание длится в среднем 14-28 дней. При нормальном уровне иммунитета и отсутствии осложнений, связанных с действием вторичной бактериальной микрофлоры, клинические признаки ослабевают к 10-14 дню заболевания, полностью исчезая к четвертой неделе с момента заболевания. У взрослых кошек летальный исход отмечают относительно редко, за исключением сильно истощенных, обезвоженных животных, или животных со сниженным иммунитетом. Тяжело протекает инфекция у кошек с сопутствующими вирусными заболеваниями: калицивирусной или короновирусной инфекцией (инфекционным перитонитом), лейкозом или иммунодефицитом.
Смерть наиболее часто наступает в результате обезвоживания, а также из-за вторичной бактериальной инфекции, которая может привести к бронхопневмонии с последующим развитием отека легких.
Пути передачи инфекции
Естественный путь заражения вирусом FHV-1 - контактный (назальные, оральные или конъюнктивальные выделения), хотя в экспериментальных исследованиях были обнаружены и другие пути распространения. Например, у беременных самок внутривлагалищная инстилляция вируса приводит к вагиниту и врожденной инфекции котят, а внутривенное заражение - к трансплацентарной инфекции и выкидышам. Тяжесть инфекции детерминируется как инфекционностью инокулируемого вируса, так и иммунным статусом животного, и практически не зависит от наличия вторичной бактериальной микрофлоры (Hoover et al., 1970).
Может также произойти косвенная передача вируса через зараженные секреторные выделения в клетках, посуду и инвентарь, персонал и так далее (особенно внутри закрытых пространств в кошачьих питомниках). Но поскольку вирусы имеют относительно короткий срок существования вне организма кошки, внешняя обстановка, как правило, не является долговременным источником распространения вируса. Аэрозольный способ передачи вируса, как полагают, не имеет большой значимости, так как существуют определенные свидетельства того, что кошка не выделяет инфекционный аэрозоль респираторных вирусов во время обычной деятельности системы дыхания. Однако чихание может привести к выбросу больших капель на расстояние свыше 1-2 метров.
Эффективность передачи зависит также от количества вируса, выделяемого инфицирующим животным, а также от длительности и близости контакта. Несмотря на то, что количество вируса при выделении больным животным и носителем может быть одинаковым, вирусы легче передаются от больных в острой фазе заболевания, а не от вирусоносителей, так как выделения у первых, как правило, более обильные. Однако, носители несомненно имеют большую значимость там, где имеют место тесные контакты, например в питомниках (R.M. Gaskel, R.C. Povey, 1977).
Вирус появляется в носовых и ротоглоточных секреторных выделениях уже через 24 часа после заражения и, как правило, активно выделяется в течение 18-30 дней. В случае латентного носительства вирус способен реактивироваться под действием факторов, понижающих иммунитет (стресс, беременность, лактация, применение кортикостероидов, сопутствующее заболевание). Реактивация вируса происходит, в среднем, через 7-10 дней после, например действия стресса, период выделения вируса в таком случае продолжается от 3-4 до 14 дней.
 
Лабораторная диагностика инфекционного ринотрахеита кошек
Безусловно, в литературе описано значительное количество методов диагностики герпесвирусной инфекции кошек, но, в данной статье, хотелось бы остановиться на методах, имеющих на наш взгляд наибольшее практическое значение.
1. Выделение вируса на культуре клеток.
В 1958 году Crandell and Maurer продемонстрировали, что вирус FHV-1 растет и вызывает цитопатический эффект в культуре клеток почки кошки, что позволило создать in vitro систему для выделения и изучения свойств FHV-1.
Для выделения вируса FHV-1 мазок берут с поверхности конъюнктивы или слизистой оболочки ротоглотки, обычно используют стерильные тампоны из хлопка или дакрона. Сразу после взятия пробы тампон помещают в пробирку с 1-1,5 мл вирусной транспортной среды с антибиотиками. При необходимости пробы замораживают и сохраняют при –70оС. Для выделения вируса обычно используют культуру клеток почки кошки CrFK, выращенную на плашках (рис. 2).



Рис. 2. Перевиваемая культура клеток почки кошки – CrFK.


Зараженную культуру клеток инкубируют при 37оС и 5% СО2 в течение 10 дней, просматривая каждые 24-48 часов для обнаружения признаков цитопатического действия вируса ИРТ кошек (рис. 3.)

Рис. 3. Цитопатическое действие вируса FHV-1, штамм «Гранд» на культуру клеток CrFK:



а). ЦПД вируса через 48ч после инокуляции,
б). ЦПД вируса через 72 ч после инокуляции.

Для подтверждения и идентификации выделенного изолята вируса FHV-1 используют метод иммунофлюоресценции со специфической антисывороткой (Nasisse и др., 1993), а также электронную микроскопию.
Основными недостатками метода выделения вируса на культурах клеток являются: длительность (до 10 дней), высокая трудоемкость, сложность, высокая стоимость, невозможность выделения вируса в случае бактериальной контаминации образцов.
Вероятно, что незрелый, необладающий достаточной инфекционностью вирус, продуцируемый на некоторых стадиях FHV-1-инфекции, ограничивает чувствительность традиционного метода выделения вируса (Reubel and others, 1993). В дополнение к этому разрушение оболочек вирионов при транспортировке, связывание вируса антителами (образование комплекса вирус-антитело) на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек также в некоторых случаях являются возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток.

2. Полимеразная цепная реакция.
Важным этапом в совершенствовании методов диагностики инфекционных заболеваний явилась разработка методов, позволяющих обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Создание принципиально нового способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые возможности для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.
Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мюллисом. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки - олигонуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидных пар (праймеры). Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n - число циклов амплификации. Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации (состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и построения фрагмента). В результате 30-35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагментов, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном гелях. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.
Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.
Метод ПЦР превосходит метод выделения вируса на культурах клеток, особенно в случае бактериальной контаминации, которая мешает традиционной технике культивирования; более чувствителен и менее трудоемок.
Наличие вторичной бактериальной и грибковой инфекции может осложнять и маскировать первичную вирусную инфекцию, затрудняя клиническую диагностику. Таким образом, существенным является возможность определения вирусных протеинов или вирусной ДНК для подтверждения диагноза первичной вирусной инфекции. ПЦР может являться одним из методов подтверждения FHV-1 инфекции в гистологических образцах в подозрительных случаях.
К сожалению, диагностика FHV-1 инфекции с помощью ПЦР-амплификации имеет ограниченную клиническую ценность, поскольку могут выявляться латентные инфекции, широко распространенные у кошек, таким образом, невозможно будет определить, играет ли FHV-1 первичную роль в возникновении заболевания, или же он просто реактивировался из латентного состояния под действием стресса или сопутствующей инфекции. Немалую роль в ограничении использования ПЦР является дороговизна оборудования и реактивов, высокая требовательность к качеству реактивов, строжайшие требования к помещениям и организации работы в ПЦР-лаборатории для исключения контаминации образцов продуктами амплификации.

3. Реакция иммунофлуоресценции.
РИФ, предложенную Кунсом еще в 1942 году, трудно отнести к новым методам исследования. Но благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела, РИФ получила в настоящее время вторую жизнь, ее чувствительность и специфичность значительно увеличены.
Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего она используется для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала как для обычной микроскопии готовят мазок на предметном стекле. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченые ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой РИФ сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе (антивидовыми)). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.
Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.
Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован помимо обнаружения антигена и для обнаружения антител. В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязанные антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов (антивидовой). В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.
В ветеринарной вирусологии РИФ активно используется для диагностики следующих вирусных заболеваний:
- вирус бешенства (непрямая),
- вирус иммунодефицита КРС (непрямая),
- коронавирус собак (непрямая),
- чума собак (непрямая),
- инфекционный перитонит (коронавирус) кошек (прямая),
- респираторный и репродуктивный синдром свиней (прямая).
РИФ является чрезвычайно ценным методом при диагностике FHV-1, при этом используют оба варианта РИФ. Для обнаружения вируса обычно берут эпителиальные клетки конъюнктивы (конъюнктивальную полость перед взятием пробы очищают от слизи и гнойных выделений), скарифицируют их под местной анестезией. При необходимости скарифицируют и эпителиальные клетки роговицы. Скарифицированные клетки помещают на предметное стекло, высушивают при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне в течение 10 минут (рис. 4).

Рис. 4. РИФ при диагностике FHV-1:



а). Клетки, инфицированные вирусом FHV-1;
б). Скопление клеточных мембран инфицированных клеток.

Метод иммунофлуоресценции можно по праву отнести к экспресс-методам диагностики, поскольку он позволяет получить результат в течение 1-1,5 часов с момента взятия образца, прост в исполнении, не требует стерильной работы.

4. Гистохимический вариант ИФА или иммунопериксидазная реакция.
Иммунопероксидазная реакция аналогична методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, и учет реакции проводят не под люминесцентным, а под обычным световым микроскопом. Обычно, в этом варианте ИФА используют антитела, меченые пероксидазой. Материалом для выявления вирус-специфических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазной реакции могут служить: мазки-отпечатки различных органов, парафиновые срезы, культура клеток, мазки крови. Аналогично РИФ иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах.

Прямой пероскидазный тест.
При выявлении антигена с его помощью используют противовирусные конъюгаты - конъюгаты, полученные из антител, выделенные из специфической сыворотки, и фермент. Например, культуру клеток, выращенную на покровных стеклах и инфицированную вирусом, или мазки-отпечатки фиксируют в течение 10 минут (например, охлажденным ацетоном), высушивают на воздухе и наносят иммунопероксидазный конъюгат в рабочем разведении. Инкубируют 1-2 часа при 37оС во влажной камере, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Наносят несколько капель раствора субстрата – диаминобензидинтетрахлорида, инкубируют 5-10 минут и промывают 10-15 минут в физиологическом растворе и ополаскивают дистиллированной водой.
В положительных случаях, то есть при наличии антигена в исследуемом препарате после нанесения иммунопероксидазного конъюгата образуется комплекс антиген-антитело, помеченный ферментом. После нанесения на препарат раствора субстрата, последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видный в световом микроскопе.
Результаты учитывают с помощью светового микроскопа. Диаминобензидинтетрахлорид под действием пероксидазы разлагается, образуя продукт реакции голубого цвета, который быстро приобретает коричневый окрас. В препарате видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. Вирус-специфический антиген в мазках и гистосрезах обнаруживают тем же способом.

Непрямой пероскидазный тест.
Используют антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты. Преимуществом непрямого метода является универсальность меченых антивидовых глобулинов, а также большая чувствительность его по сравнению с прямым тестом. Методика его постановки отличается двумя этапами: на исследуемый образец наносят специфическую для исследуемого антигена сыворотку, после инкубации и промывания наносят антивидовой пероксидазный конъюгат в рабочем разведении и инкубируют при 37оС 1 час. Далее следуют этапы, описанные в разделе о прямом методе. При наличии в исследуемом материале вирус-специфического антигена после внесения специфической сыворотки образуется комплекс антиген-антитело, для выявления которого используют антивидовые или вторичные антитела, меченые ферментом; образуется более сложный, чем в первом случае, комплекс «антиген-антитело-вторичное антитело-фермент». Полученный комплекс выявляют добавлением субстрата, который под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции. Учет результатов, как и в первом случае, проводят под световым микроскопом.
Иммунопероксидазная реакция в прямом и непрямом вариантах используется для выявления вирусов бешенства, ящура, герпесвирусов, энтеровирусов и др. На сегодняшний день, вероятно, это наиболее ценный метод для экспресс-диагностики FHV-1. Он позволяет получить четкий и быстрый диагноз, дает возможность обнаруживать как FHV-1-антиген, так и антитела к нему в мазках, мазках-отпечатках, смывах, образцах тканей и т.д. Постановка иммунопероксидазных тестов требует минимального количества реактивов и оборудования, не требует стерильности, проста в исполнении, может проводиться в любой лаборатории при наличии обычного светового микроскопа.

5. Иммуноферментный анализ.
ИФА – специфичный и универсальный метод, отличающийся высокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов. В ИФА первый известный компонент (антитело или антиген) сорбируют на твердую фазу. Следующие компоненты, включая исследуемые пробы, вносят последовательно в жидком растворенном виде. Сформировавшиеся после инкубации иммунные комплексы антиген-антитело отделяют от непрореагировавших компонентов реакции при отмывании планшет. В ИФА используют противовирусные или антивидовые антитела, меченые пероксидазой хрена (ПХ) или другими ферментами, которые затем выявляются различными субстратами (диаминобензидин, 5-аминосалициловая кислота, о-фенилендиамин). Изменение цвета регистрируется визуально или спектрофотометрически, что дает возможность проводить количественный учет результатов анализа.
Разработаны различные варианты ИФА: прямые, непрямые, методы блокирования и конкурентные. В прямых вариантах используют меченые ферментом противовирусные антитела, в непрямых – антивидовые конъюгаты. В конкурентном варианте и методе блокирования типирование и титрование исследуемых антигенов и антител обеспечивается за счет вытеснения с их помощью определенного количества меченого антигена или антитела.
Для обнаружения антител к FHV-1 ИФА ставят на многолуночных микротитровальных плашках, сенсибилизированных антигеном FHV-1 по стандартной методике. Используют как моноклональные антитела, так и поликлональные анти-кошачьи IgG, в качестве ферментной метки чаще всего используют пероксидазу хрена. Определения показателя абсорбции проводят на автоматическом ИФА-ридере с фильтром 492 нм.
ИФА – универсальный, и на сегодняшний день наиболее чувствительный и совершенный метод определения антител к FHV-1 у кошек. Он позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной и спинномозговой жидкостях, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин против FHV-1 и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета, что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания и т.д.
 
Заключение
Герпесвирусная инфекция по своей значимости занимает одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний кошек. Быстрый и точный диагноз является одним из важнейших факторов лечения и профилактики инфекционного ринотрахеита кошек. Применение методов иммунофлуоресценции, иммуногистохимии и иммуноферментного анализа для диагностики FHV-1 открывает новые перспективы в изучении и контроле этого серьезного заболевания.

Список литературы :
1. Detection of feline herpesvirus-1 DNA in corneas of cats with eosinophilic keratitis or corneal sequestration. Mark P. Nasisse, Tony L. Glover, Cecil P. Moore, Benjamin J. Weigler (American Journal Veterinary Research Vol. 59, No. 7, July 1998).
2. Detection of feline herpesvirus-specific antibodies and DNA in aqueous humor from cats with or without uveitis. David J. Maggs, Michael R. Lappin, Mark P. Nasisse (American Journal Veterinary Research, Vol. 60, No 8, August 1999).
3. Differential sensitivity of culture and polymerase chain reaction for detection of feline herpesvirus 1in vaccinated and unvaccinated cats. J.E. Sykes, G.F. Browning, G. Anderson, V.P. Studdert, H.V. Smith; (Archives of Virology 1997, 142; 65-74).
4. Feline Herpesvirus Ocular Disease. Mark P. Nasisse (Small Animal Ophthalmology, May, 1990).
5. Feline Viral Rhinotraheitis (FVR), Robert A. Crandell. Advances in veterinary science and comparative medicine. Vol. 17, Academic press New-York and London, 1973 (201-221).
6. High sensitivity polymerase chain reaction assay for active and latent feline herpesvirus-1 infection in domestic cats. B.J. Weigler, C.A. Babineau, B. Sherry, M.P. Nasisse. (The Veterinary Record, March 1997).
7. Immunologic, histologic and virologic features of herpesvirus-induced stromal keratitis in cats. Mark P. Nasisse; Robert V. English; Mary B.Tompkins; James S. Guy; Wendy Sussman (Am. J. Vet. Res, Vol. 56, No. 1, January 1995).

 К.А. Перепечаев, Д.П. Кузнецов, В.И. Уласов, ВГНИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов – центр качества ветеринарных препаратов и кормов, г. Москва, Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г. Щелково

Просмотров: 7050

стерилизация кошки стационар